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枣树基因遗传转化的研究进展

时间:2018-10-30 16:17来源:未知 作者:admin 点击:
2016年中国枣果实总产量达800万t,约占世界总产量的99%,绝大部分枣产品国际贸易集中在中国.枣果实素有“五果”(桃、李、梅、杏、枣)之称,一直深受中国人民的喜爱.其营养丰富,含有人体所需的多种氨基酸、矿物质、维生素等,其中维生素C含量在各种水果
     2016年中国枣果实总产量达800万t,约占世界总产量的99%,绝大部分枣产品国际贸易集中在中国.枣果实素有“五果”(桃、李、梅、杏、枣)之称,一直深受中国人民的喜爱.其营养丰富,含有人体所需的多种氨基酸、矿物质、维生素等,其中维生素C含量在各种水果中名列前茅.
     枣树具有胚败育率高、花小且去雄困难、落花落果严重、栽培品种种仁退化严重、长期的无性繁殖、生长枝少等独特的生物学习性,大大限制传统育种方法在枣树上的应用.而且枣树受枣疯病、枣黑斑病、枣缩果病等病害影响严重,给各地枣产业造成大量的经济损失.随着生物技术不断发展,植物细胞工程和基因工程技术正在成为现代植物品种改良的有效手段,利用这些技术进行枣树的遗传转化,可以明显缩短育种周期,定向改良枣树品种,根据人们的实际需求创造出抗病、抗逆、营养价值高的优良新品种.
 

1枣树遗传转化的方法

     目前,植物遗传转化的方法有很多,一般分为三类.第一类是外源基因直接导入法,包括电穿孔法、基因枪法、激光微束穿孔法、体内注射法、超声波法等;第二类是载体介导法,主要包括农杆菌介导法和病毒介导法;第三类是种质转化法,包括植物原位真空渗入法和花粉管通道法等,其中农杆菌介导法因为其机理清楚、技术成熟、成功实例多而成为目前使用最多的植物遗传转化系统.在木本果树转化成功的例子中,80%以上采用农杆菌介导法.枣树的遗传转化相对其他果树起步较晚,但也取得一定的成果.何业华等以茶陵沙枣、鸡蛋枣和宝玉等品种不同外植体为受体,将番茄ACC合成酶反义基因导入受体细胞,旨在抑制乙烯的合成,创造耐贮存品种;孟辉以沾化冬枣组培苗茎尖为受体,将大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因betA和拟南芥的乙酰乳酸脱氢酶突变基因als导入冬枣细胞,旨在增加枣的耐盐性和获得对磺酰脲类除草剂的抗性;黄建以木枣生根组培苗叶片为受体,将苹果山梨醇G6G磷酸脱氢酶基因S6PDH导入木枣细胞,旨在使枣树具有合成山梨醇的能力,提高枣树的抗逆性;郝征以冬枣组培苗叶片为受体,将改造的BtCrylAc基因及慈姑蛋白酶抑制剂基因API导入冬枣细胞,旨在提高枣树的抗虫能力;芪合酶基因STS可以产生植保素白藜芦醇,提高枣树的抗病能力,Luo等以壶瓶枣茎段为受体,将虎杖芪合酶基因STS导入壶瓶枣细胞;郭辉力以壶瓶枣茎段为受体,将拟南芥4G香豆酰辅酶A基因4CL和虎杖芪合酶基因STS融合后导入壶瓶枣细胞.这些研究均使用根癌农杆菌介导法,建立稳定的遗传转化体系并获得转化植株.此外郝征将发根农杆菌导入冬枣组培苗叶片和冬枣枣疯病组培苗叶片,建立发根农杆菌介导的遗传转化体系,旨在获得抗枣疯病植株.

2枣树遗传转化的影响因素

     农杆菌介导的植物遗传转化一般有以下步骤:建立植物遗传转化受体系统;对植物外植体进行切割,植物受伤后伤口部位分泌酚类物质,如乙酰丁香酮(Acetosyringone,AS)和羟基乙酰丁香酮,这些酚类物质诱导农杆菌向植物伤口部位移动;农杆菌Ti质粒上的VirA/VirG信号系统特异性识别酚类物质,诱导Vir区基因表达;VirD1和VirD2蛋白切割Ti质粒上的TGDNA左右边界产生单链TGDNA分子;TGDNA与蛋白
质形成复合体,从植物细胞外进入细胞质进一步加工后进入植物细胞核;TGDNA整合到植物基因组中.整个遗传转化过程步骤较多,每一步的优化都有可能提高遗传转化效率。
 
2.1 受体系统的建立
     植物遗传转化受体系统是指外植体在植物细胞全能性的理论基础之上,通过植物组织培养等方法,能够稳定高效再生为完整植株,并且植物细胞能够接受外源DNA的导入、对转化后进行选择的抗生素或除草剂具有敏感性.建立良好的受体系统是遗传转化的基础.受体系统一般包括组织再生系统、原生质体再生系统、胚状体再生系统、生殖细胞受体系统等.组织受体系统是指利用植物的叶片、幼茎、子叶、胚轴等外植体培养获得再生植株的受体系统,又分为愈伤组织再生系统和直接分化再生系统.愈伤组织再生系统是指外植体经过脱分化形成愈伤组织,再分化获得再生植株,具有转化率高、外植体来源容易、转化植株易扩繁等优点,但其外源基因遗传稳定性差、嵌合体(含有两种或两种以上遗传型植物组织或个体)多.直接分化再生系统是指外植体直接分化出不定芽获得再生植株,省去诱导愈伤和愈伤分化步骤,具有操作简单、体细胞无性系变异小等优点,但其转化率低、嵌合体多.早期有研究表明,枣树愈伤组织培养时分化率一般低于15%,对于遗传转化来说是远远不够的,因此目前报道的枣树遗传转化工作基本都采用直接分化再生系统.何业华等以茶陵沙枣嫩梢段和下胚轴为外植体,不定芽再生频率达90%以上,分别获得2.4%、4%的转化率,另外,以鸡蛋枣嫩梢段为外植体获得2%的转化率.下胚轴转化率明显高于嫩梢段,但常见的枣树优良品种果实成熟时胚已退化,无法使用下胚轴作为外植体,所以对于有胚品种可以优先使用下胚轴作为转化受体材料.以茎尖为外植体建立的直接分化再生系统具有良好的遗传稳定性,孟辉以茎尖为外植体,获得5.2%的转化率.黄建以木枣叶片为外植体,获得2.4%的转化率.郝征以冬枣叶片为外植体,获得8个转基因株系.Luo、郭辉力以壶瓶枣茎段为外植体,分别获得1.52%、1.83%的转化率.
 
2.2 农杆菌菌株的选择
     在农杆菌侵染植物的过程中,根据菌株类型不同、植物不同,农杆菌的侵染能力也有显著差异.例如在苹果遗传转化的研究中,张志宏等、秦玲等发现同为琥珀碱型菌株的EHA105和A281的侵染能力明显高于章鱼碱型菌株LBA4404.王关林对多种菌株进行比较后认为,菌株EHA105具有生长快、侵染能力强、培养过程不结球、培养后易洗脱等优点,更加适合作为果树遗传转化载体.在已报道的枣树遗传转化的研究中,何业华、孟辉、郝征使用菌株LBA4404,黄建、Luo等、郭辉力使用菌株EHA105,均获得成功。
 
2.3 农杆菌菌液浓度
     农杆菌菌液浓度的大小影响植物遗传转化效率.菌液浓度过低,能够侵染植物细胞的农杆菌太少,降低TGDNA进入植物细胞的几率;菌液浓度过高时则会使农杆菌进入衰亡期,大量菌体死亡,具有侵染能力的农杆菌减少,同时死亡菌体释放有害物质对植物细胞生长造成不良影响.根据植物受体部位不同、农杆菌菌种不同,用来侵染的农杆菌菌液最适浓度也不同.在已报道的枣树遗传转化的研究中,菌液浓度一般在OD6000.5~0.8
之间。
 
2.4 农杆菌侵染时间
     农杆菌侵染时间长短也是植物遗传转化效率的重要影响因素.如果侵染时间过短,吸附在植物受伤部位的农杆菌太少,无法有效完成TGDNA的转移;如果侵染时间过长,农杆菌对植物细胞的毒害作用使外植体缺氧软腐而失去活性.在已报道的枣树遗传转化的研究中,农杆菌侵染时间一般在5~20min之间。
 
2.5 Vir区基因活化诱导物的使用
     双子叶植物受伤后伤口部位会产生酚类物质如AS,这些酚类物质对农杆菌Vir区基因的活化具有重要作用,有研究表明加入适量的外源AS可以提高植物遗传转化率.AS的使用有三种方式,分别是在农杆菌菌液培养时加入AS,在共培养基中加入AS和在菌液培养、共培养基中均加入AS.第一种方法使农杆菌处于对数生长期的同时其Vir区基因也高度活化,有利于提高农杆菌的侵染能力;第二种方法使农杆菌侵染植物细胞时其Vir区基因处于高度活化状态,因为农杆菌附着在植物受伤部位后16h后才能进行TGDNA的转移;第三种方法兼顾前两种方法的优点,但也可能因AS总浓度过高而对植物生长造成不利影响.
     Nakano,Srinivasan等分别在洋桔梗和胡萝卜的遗传转化研究中发现,在共培养培养基中加入AS可以提高转化效率.Chen在蓝猪耳的遗
传转化研究中发现,在农杆菌菌液中加入AS的转化芽诱导率显著高于不加AS的转化芽诱导率.郝征在枣树遗传转化的研究中发现,农杆菌菌液或是共培养基中添加AS都可以显著提高冬枣叶片的遗传转化率.在菌液中添加AS的受体系统为愈伤组织再生系统,试验周期较长,而在共培养基中添加AS后使冬枣叶片愈伤组织再生系统变为直接分化再生系统,能够使冬枣叶片直接分化出不定芽,极大缩短遗传转化的试验周期.Luo等、郭辉力在枣树遗传转化的研究中发现,在培养基中添加60mg/LAS可以有效促进外植体丛生芽的分化,但AS浓度过高会使外植体产生褐化并死亡.
 
2.6 预培养和共培养时间
     外植体在转化前是否需要预培养,预培养多长时间,对不同植物、不同外植体的研究得到的结论并不一致.黄建在枣树遗传转化的研究中发现,预培养时间越长,获得的初代抗性芽越多,但是多代筛选后得到的抗性芽反而越少,最终从1~5d的预培养时间中选择1d作为最佳预培养时间.共培养是指在农杆菌侵染外植体后外植体和农杆菌共同生长的过程.共培养时间是影响植物遗传转化效率的重要因素,因为农杆菌附着在植物伤口部位16h后才能进行TGDNA的转移,所以共培养时间不能低于16h.共培养时间过长则会使农杆菌过度增殖对外植体产生毒害作用,一般以农杆菌覆盖外植体切口面为适度.木本果树的遗传转化大多采用1~3d作为共培养时间,在已报道的枣树遗传转化的研究中大部分确定共培养适宜时间为3~4d
 
2.7 抑菌抗生素的选择
     共培养结束后要用含有抗生素的液体共培养基对外植体进行洗涤以除去农杆菌,然后将外植体转到含抗生素的培养基上继续培养,抑制残存农杆菌的生长直到完全脱除农杆菌,这个过程称为脱菌培养.抗生素不仅可以抑制农杆菌生长,同时对不同植物的不同外植体也有不同的影响.为了减轻抗生素对植物的不良影响,需要对抗生素的种类和浓度进行筛选.目前,常用的抑制细菌生长的抗生素有羧苄青霉素(Carbenicillin,Cb)和头孢霉素(CefotaximeSodiumSalt,Cef),已报道的枣树遗传转化研究中大部分使用的是Cb,只有孟辉的研究使用Cef。
黄建在枣树遗传转化的研究中发现,Cb可以促进叶片外植体形成愈伤组织,但高浓度Cb对愈伤组织有不利影响,而Cef对愈伤组织没有明显影响.郝征比较头孢曲松钠(CeftriaxoneSodium,CRO)和Cb的使用效果,发现两种抗生素都有良好的抑菌效果,但对冬枣叶片分化出芽有抑制效果,而Cb的抑制效果较CRO更弱,因此选择Cb作为抑菌抗生素.Luo等、郭辉力比较Cef和Cb对壶瓶枣丛生芽分化的影响,发现Cb对丛生芽分化的影响优于Cef.
 
2.8 选择压加入的时期
     外植体经过农杆菌进行侵染和共培养后,并非所有植物细胞都能成功整合农杆菌TGDNA,一般将成功整合TGDNA的植物细胞称为转化细胞,反之称为非转化细胞,转化细胞中含有抗生素或除草剂的抗性基因,因此可以在选择培养基中添加抗生素或除草剂对转化细胞进行筛选,这种抗生素或除草剂对转化细胞的选择作用称为选择压.选择压加入培养基的时期可以分为三种:前期选择、延迟选择和后期选择.前期选择是指先进行选择培养后再生为完整植株.这种方法可以较早去除非转化细胞,减少嵌合体的产生,转化体的纯化方便,但也有植物进行前期选择后未得到转化植株.后期选择是指先得到愈伤组织、不定芽或再生植株后再进行选择培养,由于非转化细胞对转化细胞具有滋养作用,使用延迟选择可以让转化细胞更好生长,但是产生的嵌合体较多,转化体的纯化困难.延迟选择则是当愈伤组织或不定芽诱导开始时不加选择压,过一定时间后再加入选择压,这样既能促进转化细胞生长又能减少嵌合体产生,因此很多人采用延迟选择的方法.总之,不同植物的最适选择压加入时期也不相同.Mathews等在草莓遗传转化的研究中发现逐步提高选择压可以明显减少嵌合体的产生而保持选择压不变则无此效果.在已报道的枣树遗传转化研究中,何业华、黄建使用前期选择,而孟辉、郝征、Luo等、郭辉力使用延迟选择.孟辉在冬枣茎尖遗传转化的研究中,共培养后延迟7d加入抗性压进行筛选.为了增大植物细胞与筛选剂的接触面积,提高选择效率,孟辉不仅在固体培养基中加入筛选剂,同时向茎尖滴加相同浓度的筛选剂溶液.此外,为了及时去除非转化细胞,减少嵌合体的产生,孟辉在选择培养的继代过程中,使用将幼芽外植体的坏死部分切除,然后转移到新培养基上继续培养的方法。
 
2.9 AgNO3在叶片再生体系中的作用
     除直接分化再生体系,黄建、Luo等也对枣树叶片愈伤再生体系进行研究.褐化现象是愈伤组织培养的重要限制因素,而农杆菌对植物的毒害作用会加重植物褐化程度,严重时导致外植体死亡.有研究表明,在植物遗传转化中,AgNO3具有抑制农杆菌生长、抑制褐化、促进抗性芽分化、提高转化率、减少假阳性转化体的作用.在枣树叶片愈伤再生体系的研究中,黄建和Luo等均使用5mg/L的AgNO3,取得较好的促进愈伤分化和减轻褐化的效果。
 

3转基因植物的鉴定

     为了确定外源基因是否进入植物细胞,进入植物细胞的外源基因是否整合到植物染色体上,整合的方式如何,整合到染色体上的外源基因是否表达等一系列问题,有必要对转基因植物进行检测鉴定.目前已经发展出一系列的转基因植物的检测和鉴定方法.根据检测的基因功能分为调控基因(启动子和终止子)检测、选择标记基因检测和目的基因直接检测.根据检测的不同阶段分为整合水平检测和表达水平检测.外源基因整合检测有Southern杂交、PCR、PCRGSouthern杂交、原位杂交和DNA分子标记技术等;表达水平的检测有Northern杂交、逆转录PCR(RTGPCR)、酶联免疫吸收法(ELISA)和Western杂交等。
     已报道的枣树遗传转化研究一般使用PCR的方法初步验证遗传转化是否成功.在此基础上,何业华对7株PCR阳性转化植株使用Southern杂交分析,证明其中6株的ACC反义基因成功整合到枣树染色体上.进一步使用RealGtimePCR对6株Southern杂交阳性植株和1株Southern杂交阴性植株的基因表达进行分析发现,阳性植株中含有ACC合成酶反义基因RNA而阴性植株中未检测到,证明ACC反义基因在转录水平得到表达.Luo等通过荧光实时定量技术比较3个不同转化植株中表达效率,结果发现株系2是其他两个株系的1.16倍;通过液相色谱G质谱联用(HPLCGMS)分析确定转基因壶瓶枣样品中存在白藜芦醇,其鲜重含量为0.45μg/g.郭辉力通过PCRGSouthern杂交和Northern杂交证明4CLGSTS融合基因已整合到壶瓶枣基因组DNA中,且得到转录水平表达.进一步通过HPLCGMS分析确定转基因壶瓶枣样品中存在白藜芦醇,其鲜重含量为2.07μg/g,是转STS单基因枣树的4.6倍。
 

4转基因植物的功能验证

     外源基因转入植物后,能否发挥预期的功能是遗传转化是否成功的重要标志.目前仅有Luo等、郭辉力进行转基因枣树材料功能方面的验证.Luo等研究发现,相对野生型材料,转入STS基因的植物材料中叶片、茎干和茎尖等100μL提取液对桃褐腐真菌(Moniliniafrvcticola)抑菌率分别为25.0%、28.57%和16.07%,抑菌效果相当于1μg白黎芦醇样品(抑菌率为23.08%),同时对枣常见真菌病原菌抑菌效果显著,此外发现螨(TetranychusGcinnabarinus)对转基因遗传材料有趋避的现象.郭辉力发现转4CLGSTS融合基因的植株对枣树常见真菌病原菌有明显的抑制作用.
 

5存在的问题及展望

     枣树是中国第一大干果树种,具有重要的经济价值和生态价值.近年来基因工程技术在枣树研究中得到广泛的应用,取得一些重要进展,但与其他果树和农作物相比,枣树的遗传转化研究仍然处于起步阶段,还存在不少问题,具体表现在:
     受体系统不易建立.枣树作为木本植物,组培困难,且存在愈伤组织分化率低的问题,所以大部分研究使用外植体直接分化体系.转化率偏低.由于枣树是木本植物,遗传转化较为困难,且大部分研究使用外植体直接分化再生体系,导致枣树转化率偏低.嵌合体严重.无论是愈伤再生体系还是直接分化再生体系,都存在嵌合体多的问题,给后续的筛选造成困难.功能基因的遗传转化未得到实践检验.目前大部分研究只得到转基因植株,但是没有对转基因植株进行具体的生理生化测定试验和嫁接试验,因此无法评定其在生产实践中的具体效果.随着转基因技术不断发展,未来可以进行枣重要性状基因的定位与克隆,建立和优化受体系统,优化遗传转化条件,优化筛选方法等,提高枣树遗传转化率,加快枣树的定向育种,有望培育出抗性强、口感好、营养高、具有保健品质的优良品种.

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